Kisspeptinmolekulyar og'irligi taxminan 6000 Dalton bo'lgan 54 ta aminokislotalar qoldig'idan tashkil topgan kichik molekula peptididir. Uning aminokislotalar ketma-ketligi sutemizuvchilarda yuqori darajada saqlanib qolgan, ya'ni u turli turlarda o'xshash tuzilishga ega. Odamlarda Kisspeptinning aminokislotalar ketma-ketligi H-Phe Gly Gly Leu Ser Arg Arg Al Glu Leu Ser Arg Arg Al Glu Leu Ser Arg Arg Al Glu Leu Ser Eu Ser Arg Al Glu Eu Ser Arg. Kiss1 geni tomonidan kodlangan bu gen birinchi navbatda Kiss1 oqsili prekursoriga transkripsiya qilinadi, u pirovardida etuk Kisspeptinni hosil qilish uchun bir qator qayta ishlash va biriktirishdan o'tadi. Kisspeptinning parchalanishi asosan peptidazalar orqali amalga oshiriladi, ular uni kichikroq bo'laklarga yoki alohida aminokislotalarga parchalaydi. Reproduktiv tizimda hal qiluvchi rol o'ynaydi. Bu gonadotropinlarning chiqarilishini rag'batlantirishi va shu bilan jinsiy hujayralarning kamolotini va ovulyatsiyasini rag'batlantirishi mumkin bo'lgan muhim gonadotropinni chiqaradigan gormon (GnRH) chiqaradigan omil hisoblanadi. Bundan tashqari, Kisspeptin hissiyot, xotira va kognitiv funktsiya kabi boshqa fiziologik jarayonlarni tartibga solishda ham ishtirok etadi.
Kiss1 peptid yoki RFRP{1}} peptidi sifatida ham tanilgan kisspeptin peptidi inson tanasida topilgan neyropeptiddir. Laboratoriyada Kisspeptinni sintez qilish uchun odatda quyidagi sintez usullari qo'llaniladi:
Kimyoviy sintez:
Kimyoviy sintez laboratoriyada Kisspeptinni sintez qilishning eng keng tarqalgan usuli hisoblanadi. Bu usul kondensatsiya, himoyasizlanish va tuzsizlantirish kabi bir nechta kimyoviy reaktsiyalarni o'z ichiga oladi. Ular orasida asosiy qadam aminokislotalar o'rtasida peptid bog'lanishlarining shakllanishi bo'lib, odatda EDC (1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) - karbodiimid) yoki BOP ( kabi klassik bog'lovchi vositalar yordamida benzotriazol-1-il-oksi-tris (dimetilamino)fosfoniy geksaftorofosfat). Kimyoviy sintezning afzalligi shundaki, u yuqori tozalikdagi Kisspeptinni olishi mumkin, ammo bu usulning kamchiligi shundaki, u mashaqqatli eksperimental bosqichlarni va qat'iy laboratoriya sharoitlarini talab qiladi, hosil esa past bo'ladi.
Maxsus reaktsiya bosqichlari quyidagilardan iborat:
1. Boshlang'ich materiallarni tayyorlang. Bunga kerakli aminokislotalar, aktivatorlar (masalan, EDC yoki BOP), himoyani yo'qotish reagentlari (masalan, trifloroatsetik kislota yoki gidrobromik kislota), shuningdek, boshqa zarur reagentlar va bufer eritmalar kiradi.
2. Suvsiz va kislorodsiz sharoitda kerakli aminokislotalarni dimetilformamid (DMF) yoki N, N-dimetilasetamid (DMA) kabi tegishli erituvchilarda eritib yuboring.
3. Kerakli aktivatorni (masalan, EDC yoki BOP) qo'shing va peptid bog'larini hosil qilish uchun xona haroratida ma'lum vaqt davomida aralashtiring.
4. Aminohimoya guruhlarini olib tashlash uchun hosil bo'lgan peptid bog'lariga himoya qiluvchi reagentlarni (masalan, trifloroatsetik kislota yoki gidrobromik kislota) qo'shing.
5. Yangi hosil bo'lgan aminokislotalarni himoya qilish uchun kerakli himoya guruhlarini (masalan, Boc yoki Fmoc) qo'shing.
6. Barcha kerakli aminokislotalar ulanmaguncha yuqoridagi amallarni takrorlang.
7. Peptid zanjiriga kerakli yon zanjir modifikatsiyalari va/yoki markerlarni qo'shing.
8. Nihoyat, barcha himoya guruhlarini olib tashlash va tozalangan Kisspeptinni olish uchun himoyadan chiqarish reaktsiyasi o'tkazildi.
Yuqorida aytilganlar asosiy kimyoviy sintez usuli bo'lib, maxsus qadamlar Kisspeptinning o'ziga xos ketma-ketligiga va kerakli o'zgarishlarga qarab farq qilishi mumkin. Butun sintez jarayonida reaksiyaning silliq borishini va mahsulotning yuqori tozaligini ta'minlash uchun eksperimental sharoitlarni, jumladan erituvchi, harorat, pH, vaqt va bosimni qat'iy nazorat qilish kerak. Shu bilan birga, kimyoviy reaktsiyalarning xavfsizligiga e'tibor berish va xavfli reagentlar va operatsiyalarni qo'llashdan qochish kerak.
Genetik muhandislik sintezi:
Genetik muhandislik sintezi Kisspeptin sintezining samarali, tez va iqtisodiy usuli hisoblanadi. Bu usul Escherichia coli yoki xamirturush kabi mikroorganizmlarda Kisspeptinning prekursor oqsilini ifodalash uchun genetik muhandislik texnologiyasidan foydalanadi va keyin etuk Kisspeptinni olish uchun keyingi ishlov berishdan o'tadi.
Quyidagi jarayon soddalashtirilgan:
1. Genlarni klonlash: Birinchidan, Kisspeptinning gen ketma-ketligini olish kerak. Buni biologik to'qimalardan RT PCR, genom sekvensiyasi yoki boshqa genlarni klonlash usullari orqali olish mumkin.
2. Vektor tanlash: Keyinchalik, Kisspeptinning gen ketma-ketligini joylashtirish uchun vektorni tanlashingiz kerak. Bu odatda zararsiz bakterial plazmid yoki virus vektoridir. Vektor Kisspeptin genini kiritish va uni hujayra ichiga olib kirish uchun mo'ljallangan.
3. Gen transformatsiyasi: Kisspeptin genini vektorga kiriting va keyin bu kompleksni (gen+vektor) Escherichia coli yoki xamirturush kabi muhandislik bakteriyalariga o'tkazing.
4. Ifoda: Muhandislik bakteriyalarida Kisspeptin geni "o'qiladi" va oqsil sintezini boshqaradi. Ushbu oqsillar odatda keyingi tozalash jarayonlari uchun maxsus kimyoviy belgilarga biriktiriladi.
5. Qayta ishlashdan keyingi: Bu Kisspeptin prekursor oqsillari ishlab chiqarilgan bakteriyalar tomonidan to'planishi va hujayra parchalanishi, santrifüjlash va dializ kabi bosqichlar orqali tozalanishi mumkin.
Ushbu usulning afzalligi shundaki, u qisqa vaqt ichida katta miqdorda Kisspeptin ishlab chiqarishi mumkin va narxi nisbatan past. Bundan tashqari, mikroorganizmlardan foydalanish tufayli ushbu ishlab chiqarish usuli atrof-muhitga minimal ta'sir ko'rsatadi. Biroq, bu usulning nochorligi shundaki, u mikroorganizmlarning manipulyatsiyasini talab qiladi va shuning uchun ma'lum laboratoriya jihozlari va ko'nikmalarini talab qiladi.
Bioenzimatik gidroliz:
Bioenzimatik gidroliz - ferment kataliz yordamida Kisspeptinni sintez qilish usuli. Bu usul Kisspeptin prekursor oqsillarini etuk Kisspeptinga aylantirish uchun maxsus biologik fermentlardan foydalanadi.
Biologik fermentativ gidroliz orqali Kisspeptinni sintez qilishning asosiy bosqichlari:
1. Genlarni klonlash va vektor tanlash: Birinchidan, Kisspeptinning genlar ketma-ketligini olish va keyin uni kiritish uchun vektorni tanlash kerak.
2. Ifoda: Kisspeptin genini vektorga kiriting va keyin bu kompleksni (gen+vektor) muhandislik bakteriyasiga o'tkazing.
3. Protein sintezi: muhandislik bakteriyalarida Kisspeptin geni "o'qiladi" va oqsil sintezini boshqaradi. Bu oqsillar odatda maxsus kimyoviy yorliqlarga biriktiriladi.
4. Bioenzimatik gidroliz: prekursor oqsillarni etuk Kisspeptinga aylantirish uchun subtilisin yoki tripsin kabi maxsus proteazlardan foydalanish. Biologik fermentlar yuqori o'ziga xoslik va katalitik samaradorlikka ega, shuning uchun reaktsiyaning bu bosqichi tez va samarali bajarilishi mumkin.
5. Keyingi ishlov berish: Hujayra parchalanishi, santrifüjlash, dializ va boshqalar kabi bir qator bosqichlar orqali Kisspeptin nihoyat yig'iladi va tozalanadi.
Bu usulning afzalligi shundaki, u qisqa vaqt ichida Kisspeptin sintezini yakunlay oladi. Sintez tezligi nafaqat tez, balki biologik fermentlarning katalitik samaradorligi ham nihoyatda yuqori, bu maqsadli oqsillarning hosildorligini sezilarli darajada yaxshilaydi. Ayni paytda, fermentativ gidrolizda ishlatiladigan biologik fermentlar ko'pincha yuqori o'ziga xoslikka ega va murakkab biologik molekulalarda aniq va samarali ishlashi mumkin. Shuning uchun bu usul ekologik jihatdan qulay va maqsadli oqsilning tuzilishi va funktsiyasiga kam ta'sir qiladi. Biroq, bu usulda biologik fermentlarni olish va tayyorlashdagi qiyinchiliklar, yuqori xarajatlar va reaksiya sharoitlarini aniq nazorat qilish zarurati kabi ma'lum cheklovlar ham mavjud.
Hujayra madaniyati:
Hujayra madaniyati laboratoriyada Kisspeptinni sintez qilish usuli hisoblanadi. Bu usul Kisspeptin gen ketma-ketligini o'z ichiga olgan hujayra chizig'ini etishtirishni va undan keyin ajratilgan Kisspeptinni madaniy muhitdan yig'ishni o'z ichiga oladi. Xususan, Kisspeptinning gen ketma-ketligi birinchi navbatda hujayra chizig'iga kiritiladi, so'ngra hujayra madaniyati va holatni optimallashtirish amalga oshiriladi. Nihoyat, Kisspeptin madaniy muhitdan yig'iladi. Hujayra madaniyatining afzalligi shundaki, u ko'p miqdorda Kisspeptin ishlab chiqarishi mumkin va bu usulning ishlashi nisbatan sodda.
Xulosa qilib aytganda, laboratoriyada Kisspeptinni sintez qilishning turli usullari mavjud va har bir usulning o'ziga xos afzalliklari va kamchiliklari mavjud. Haqiqiy ehtiyojlarga qarab sintez qilish uchun mos usullar tanlanishi mumkin. Ular orasida kimyoviy sintez va genetik muhandislik sintezi eng ko'p qo'llaniladigan usullar, fermentativ gidroliz va hujayra madaniyati esa boshqa mumkin bo'lgan usullardir.