Aprotinin CAS 9087-70-1

Aprotinin78R2S7, C284H432N84O molekulyar formulasi, CAS 9087-70-1, bu tripsin va ximotripsinni inhibe qiladigan, oshqozon osti bezidagi boshqa faol proteazomalarning faollashishini va tripsinogenning o'zini faollashishini oldini oladigan proteaz inhibitori. O'tkir pankreatitning oldini olish va davolashda, fibrinoliz natijasida kelib chiqqan qon ketishda va keng tarqalgan intravaskulyar koagulyatsiyada qo'llaniladi. Bundan tashqari, zarbaga qarshi davolash uchun ham foydalanish mumkin. Proteaz inhibitörleri fermentlar bilan bog'lanishi va substratning parchalanish tezligini kamaytiradigan moddalardir. Protein xossalariga ega bo'lgan proteaz inhibitörleri keng tarqalgan bo'lib, oqsil xossalariga ega bo'lgan ikki turdagi proteaz inhibitörleri soyadan ajratilgan: Kuniz tripsin inhibitori va Baumann Bellck inhibitori. Birinchisining molekulyar og'irligi 20-25 ku, ikkinchisining molekulyar og'irligi 8 ku.

Rekombinantaprotinin(RTI16) kininaz va tripsinni inhibe qilishi mumkin va u tabiiy o'ziga xos bo'lmagan{1}}serin proteaz inhibitori hisoblanadi. Bu 58 ta aminokislota qoldig'idan tashkil topgan, zanjirda 3 ta disulfid bog'lari-o'zaro bog'langan bir zanjirli asosli oqsildir. Uzoq vaqt davomida aprotin o'tkir pankreatitni davolash uchun ishlatilgan. 1990-yillardan keyin rekombinant aprotin trombotsitlarni himoya qilish, qon ketish va ekssudatsiyani kamaytirish, koagulyatsion buzilishlari bo'lgan bemorlarni klinik davolash uchun kardiotoraks jarrohlikda qo'llanila boshlandi. Shu sababli, aprotinning bozor hajmi tez kengayib, muhim biokimyoviy preparatlardan biriga aylandi.

Sintez

 

Hozirgi vaqtda sotuvda mavjud bo'lgan rekombinant aprotin preparatlari, asosan, murakkab jarayonlar va yuqori xarajatlarga ega bo'lgan qoramol o'pkasi kabi organlardan olingan ekstraktlardir. Shuning uchun gen muhandisligi usullaridan foydalangan holda rekombinant aprotin ishlab chiqarishni o'rganish katta ahamiyatga ega.

Sekretsiyani ifodalash tizimidan foydalanganda aprotin ishlab chiqarish odatda past bo'ladi va hosil bo'lgan mahsulotning faolligi ham past bo'ladi. Birlashma ifodasi orqali rekombinant aprotinning ifoda darajasini sezilarli darajada oshirishi kutilmoqda.

 

Shu maqsadda rekombinant aprotinni ifodalovchi plazmid pGrxA BPTI yaratilgan va termoyadroviy sherik va rekombinant aprotin o'rtasida FXa ni tanib olish joyi yaratilgan. Inklyuziya tanasi shaklida ifodalanganidan so'ng, termoyadroviy sherik tozalangan va gel filtrlash orqali qayta katlangan. Tabiiy mahsulot bilan bir xil faollikdagi oqsilni olish uchun termoyadroviy sherik FXa tomonidan eksize qilingan. Ekspressiya shartlarini optimallashtirish orqali hosil oldingi ifodalash tizimlariga nisbatan sezilarli darajada yaxshilandi.

Muhandislik bakteriyalarining ekspressiyasini optimallashtirish:

 

Glitserin naychali bakteriyalarni LB/AMP agar plastinalariga seping, 20 soat davomida 37 daraja haroratda eking, koloniyalarni qirib tashlang va ularni 5 ml LB/AMP suyuq muhitiga 37 daraja, 200 r/daqiqada va bir kechada eking. Emlashning 5% ni 100 ml makkajo'xori bulami muhitiga soling, 37 daraja va 220 rpm / min da silkitgichda eking, 7 soat davomida induktsiya qiling va keyin bakteriya hujayralarini to'plash uchun santrifüj qiling (8000 r / min, 5 min, 4 daraja). Bakteriya hujayralarining nam vaznini torting va ularning ifodasini 15% SDS-PAGE orqali aniqlang.

Fermentatsiya tankida etishtirish

 

Fermentatsiya tankida etishtirish:

Nemis Biostat 30 L fermentatsiya idishidan foydalanish, 37 daraja, erigan kislorod 20%, pH 7,0 da nazorat qilinadi. Termoyadroviy oqsilni ifodalash uchun fermentatsiya tankidan foydalanib, 260 g nam bakterial hujayralar 16 L fermentatsiya bulonidan, taxminan 16 g / L dan olingan; Ifoda darajasi taxminan 45% ni tashkil qiladi,

Devorning sinishi va bakterial hujayralarning tanaga kirishi:

 

Kultivatsiya tugagandan so'ng, bakteriya hujayralarini yig'ing, 10 ml A eritmasiga 1 g bakterial hujayra qo'shing (50 mmol / L Tris HCl, pH 8,0, 1 mmol / L EDTA), ularni yaxshilab to'xtatib turing, hujayralarni muzli hammomda sonikatsiya qiling, 30 soniya davomida ishlang, 30 soniya davomida quvvat, 10 soniya davomida quvvat. Suyuqlikni santrifüj trubasiga o'tkazing, 15 daqiqa davomida 4 daraja va 8000 r / min tezlikda santrifüj qiling va cho'kma xom inklyuziya tanasi hisoblanadi.

Inklyuziya tanasini eritish uchun eritma tayyorlash:

 

Xom inklyuziya tanasini B (50 mmol/L Tris HCl, pH 8,0, 1 mmol/L EDTA, 1% Triton-X100) eritmasi bilan ikki marta, har safar 0,5 soat davomida yuving, supernatantni olib tashlash uchun santrifüj qiling va nisbatan toza inklyuziya tanalarini oling. 5 ml C eritmasiga (50 mmol/L Tris HCl, pH 8,0, 8 mol/L karbamid, 1 mmol/L EDTA, 5 mmol/L DTT) 1 g inklyuziya tanalarini qo‘shing, 4 gradusda bir kechada inkubatsiya qiling, denatüratsiya qiling va eritib oling, 1200 daqiqa davomida santrifüj qiling va supero‘tkazgichni oling. inklyuziya tanasini eritish eritmasi. Rekombinant aprotinni oling.

Farmakologik ta'siri:

 

 

Aprotininma'lum bir kimyoviy nisbatda hosil bo'lgan teskari ferment inhibitör komplekslari orqali inson tripsini, fibrinolitik ferment, plazma va to'qima angiotensinini inhibe qiladi. Serin faolligi bo'lgan proteazlar vazopressin kininogen kinin tizimi, komplement tizimi va koagulyatsiya tizimida katta rol o'ynaydi, bu erda plazmin va plazma vazopressin muhim rol o'ynaydi.

 

Aprotinn o'zining inhibitiv ta'sirini fermentning serin faol qismi orqali aprotin proteaza kompleksini hosil qilish orqali amalga oshiradi. Biroq, turli proteazlar bilan birlashganda, u turli xil dissotsiatsiya konstantalarini namoyon qiladi. Tripsin bilan bog'lanish eng kuchli (Ki{2}}nmoN) bo'lib, u oqsillar o'zaro ta'sirida qayd etilgan eng past konstantalardan biridir (Laydunski va boshqalar. 1974). Inson fibrinolitik fermenti bilan bog'lanish unchalik kuchli emas. Ferment inhibitör kompleksining yuqori K qiymati (Ki=1 nmoN) tufayli u qaytarilishi mumkin (Wimann, 1980) va inson plazmasidagi angiotensin bilan bogʻlovchi kompleks ancha zaif (Ki=30 nmol/l), lekin baribir aprotinning terapevtik chegarasida (Nakahar, 1983).

 

Aprotinn nafaqat erkin ferment molekulalari, balki allaqachon uchinchi komponent bilan bog'langan fermentlar bilan ham bog'lanadi (agar fermentning faol markazi hali ham bog'lanish qobiliyatiga ega bo'lsa). Shuning uchun aprotinn erkin fibrinolitik fermentlarni inhibe qiladi va zanjir kinaz bilan trombolitik terapiya paytida hosil bo'lgan oraliq fibrinolizin zanjir kinaz kompleksini ham inhibe qilishi mumkin (Wimann, 1980).
Aprotinning antifibrinolitik ta'siri oqsil gidrolizi bilan faollashtirilgan plazminni inhibe qilishga asoslangan. Sintetik antifibrinolitik erituvchilardan farqli o'laroq, haddan tashqari faollashtirilgan plazminni to'g'ridan-to'g'ri inhibisyonu tufayli aprotin nafaqat to'g'ridan-to'g'ri substratni (fibrin) plazmin tomonidan degradatsiyadan himoya qiladi, balki fibrinogenni, plazmadagi V va VIII omillarni va sarumdagi alfa 2-globulinni ham himoya qiladi.

 

Endotoksin bilan qo'zg'atilgan shok va gipovolemik shok tajribalarida Trasilol kininogenning faollashuvini sezilarli darajada inhibe qilishi mumkin. (Massion va boshqalar, 1972).
Trasilol o'pkaning interstitsial shishi (o'pka zarbasi) rivojlanishini oldini oladi yoki kechiktirishi mumkin. Uning inhibitiv ta'siri dozaga-va vaqtga{2}} bog'liq (Lortioir va boshq., 1973).
Shok paytida ishemik oshqozon osti bezi juda zaharli peptid moddasini, ya'ni miokard inhibitiv omilini (MDF) ishlab chiqarishi mumkin. Bu omil shokdan o'lim bilan chambarchas bog'liq.

 

MDF sichqonlar, itlar, maymunlar va odamlarning plazmasida gemorragik, septik, kardiogen shok va kuyish shoki bilan aniqlanishi mumkin. MDF qon ketishining barcha holatlarida miyokard kontraktiliyasining pasayishiga olib kelishi mumkin va shu bilan birga, u visseral qarshilik tomirlarining qisqarishiga olib keladi, mahalliy ishemiyaga va ko'proq MDF ishlab chiqarilishiga olib keladi. Bundan tashqari, retikuloendotelial tizimga etkazilgan toksik shikastlanish tufayli uning qon oqimida tozalanishi kechiktiriladi. Trasilol MDF ishlab chiqarishni sezilarli darajada oldini oladi (Lefer 1984).

Aprotinin, fibrinolizga qarshilik ko'rsatadigan kichik molekulali birikma sifatida muhim va o'ziga xos ferment inhibitiv xususiyatlarini namoyish etadi. U nafaqat tripsin faolligini samarali ravishda inhibe qiladi, balki boshqa tegishli proteolitik fermentlarga ham keng ta'sir qiladi, shuning uchun hujayra biologiyasi tajribalarida muhim rol o'ynaydi. Ayniqsa, hujayra va to'qimalarning parchalanishi va gomogenizatsiyasi paytida Aprotinn samarali proteaz inhibitori bo'lib xizmat qilishi mumkin, bu maqsadli oqsillarning tasodifiy degradatsiyasini samarali oldini oladi, bu namunaning yaxlitligi va aniqligini saqlab qolish uchun juda muhimdir.

Aprotinning inhibitiv ta'siri aniq dozaga bog'liqligini ko'rsatadi, ya'ni uning kontsentratsiyasi ortishi bilan fibrinolitik faollikka inhibitiv ta'sir ham mos ravishda kuchayadi. Bu xususiyat tadqiqotchilarga yanada ishonchli va takrorlanadigan eksperimental natijalarni olish uchun eksperimental sharoitlarni aniqroq nazorat qilish imkonini beradi. Shu bilan birga, Aprotinn qonning ivish vaqtini uzaytirishi mumkin, bu uning koagulyatsion mexanizmdagi muhim rolini tasdiqlaydi. In vitro tajribalari shuni ko'rsatdiki, Aprotinn samarali endogen koagulyatsion yo'l inhibitori bo'lib, koagulyatsiya jarayonidagi asosiy jarayonlarga xalaqit berishi va ularni tartibga solishi mumkin.

Aprotini o'zining noyob farmakologik ta'sirini ham ko'rsatdi. Bu in vitroda qon pıhtılarının erishi jarayonini sezilarli darajada inhibe qilishi, kalamushlarda quyruqdan qon ketish vaqtini uzaytirishi va inson plazmasida koagulyatsiya vaqtini uzaytirishi mumkin. Ushbu topilmalar Aprotinning qon ketishiga qarshi va trombotik ta'sirga ega bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi. Uning in vivo ta'sirini yanada tasdiqlash uchun tadqiqotchilar kalamush arteriovenoz qisqa tutashuv modelida tajribalar o'tkazdilar. Natijalar shuni ko'rsatdiki, Aprotnin qon pıhtılarının og'irligini sezilarli darajada kamaytirishi mumkin, bu uning antitrombotik dori sifatida potentsialini qo'llab-quvvatlaydi.

Xulosa qilib aytadigan bo'lsak, Aprotnin fibrinolizni inhibe qiluvchi kichik molekulali birikma sifatida in vitro va in vivo ham muhim ferment inhibitiv xususiyatlarini va farmakologik ta'sirini ko'rsatdi. Uning hujayra biologiyasi tajribalarida qo'llanilishi tadqiqotchilarni kuchli vositalar bilan ta'minlaydi, shu bilan birga in vivo tadqiqotlardagi topilmalar uning qon ketishiga qarshi va trombotik dori sifatida rivojlanishi uchun muhim maslahatlar va asoslar beradi. Kelajakda, Aprotninning ta'sir qilish mexanizmi bo'yicha keyingi tadqiqotlar va klinik sinovlar bilan biz uning tibbiyot sohasida kengroq qo'llanilishini ko'rishimiz kutilmoqda.

Issiq teglar: aprotinin cas 9087-70-1, yetkazib beruvchilar, ishlab chiqaruvchilar, zavod, ulgurji, sotib olish, narx, ommaviy, sotuv